R6 - Evaluación de los piensos tras el estudio en la granja experimental, derivados de los controles productivos, epidemiológicos, clínicos, de patógenos en heces y del estado del sistema inmunitario, realizados durante el ensayo in vivo. Selección/clasificación de los piensos validados por grado de eficacia.

Se ha completado la caracterización nutricional, microbiológica y del efecto antimicrobiano e inmunomodulador de los piensos experimentales, así como la valoración zootécnica de la prueba in vivo. Con ello, se ha elaborado el checklist clínico, epidemiológico 

y productivo y estudio de heces y sangre para evaluar el efecto de los piensos experimentales. Tras la evaluación in vitro del efecto inmunomodulador y antiinflamatorio, cabe destacar el efecto inmunoestimulante de los piensos fabricados a gran escala. Los resultados obtenidos también muestran que no se han encontrado diferencias significativas entre los distintos piensos en los parámetros relativos al estado inmunitario. Los datos de concentración de citoquinas en sangre han presentado una alta variabilidad, probablemente debido a la dificultad en la extracción de muestras y la baja concentración (a nivel de pg/ml) en la detección de las proteínas. 

R5 - Caracterización analítica de los 3 ingredientes y de los piensos seleccionados in vitro por su mayor eficacia.

Se obtuvo la caracerización analítica y microbiológica de los piensos experimentales, concluyendo que todos ellos cumplían con los parámetros de calidad en cuanto a los parámetros fisicoquímicos analizados, así como a los resultados microbiológicos. También se analizó la presencia de micotoxinas y se obtuvieron resultados conformes según los límites de calidad establecidos para cada micotoxina y para pienso experimental, sin que supongan por tanto afección en la calidad final del pienso.

Por otro lado, se realizó un análisis por triplicado para cada tipo de pienso experimental de los elementos traza (macrominerales) que sirven de marcadores de la homogeneidad y correcta integración de materas primas y núcleos. Los resultados obtenidos permitieron concluir que todos son conformes y ajustados a la formulación, con ligeras variaciones en alguno de los parámetros debido a la aportación a mayores de los núcleos, si bien no fueron significativos. Asimismo, se analizó la durabilidad, acidez y la calidad granulométrica, que también resultó dentro de los parámetros previstos.

Por último, se ha procedido a la evaluación en términos analíticos de los piensos e ingredientes seleccionados (caracterización físico-química, caracterización microbiológica,  análisis biomolecular, caracterización de sustancias no deseadas y estudio de vida útil).

R4 - Selección de hasta 6 piensos formulados con los ingredientes que, tras simular el proceso de digestión gastrointestinal aviar, muestran capacidad antimicrobiana, inmunomoduladora y/o antiinflamatoria.

Se han realizado los ensayos de simulación de la digestión gastrointestinal aviar in vitro con los piensos que incorporan los ingredientes seleccionados, obteniendo el digerido gastrointestinal de los piensos formulados que ha permitido evaluar su capacidad antimicrobiana e inmunomoduladora.También se ha realizado la evaluación de capacidad antimicrobiana de los digeridos de los piensos aditivados con ingredientes a base de hongos y/o algas, no encontrándose efectos antimicrobianos frente a la microbiota diana en las condiciones ensayadas. Por último, se ha realizado la evaluación de los digeridos de los piensos mostrando un potencial efecto beneficioso, en concreto un efecto inmunoestimulante, de los piensos formulados que incluyen la combinación hongo+microalga. Ninguno de los digeridos de los piensos formulados ha mostrado un resultado negativo frente a la actividad inmunomoduladora o antiinflamatoria.

Por lo tanto, los resultados obtenidos demuestran que ninguno de los piensos formulados ha mostrado un efecto negativo, e incluso en los experimentos in vitro se ha observado que podrían causar un efecto beneficioso en el sistema inmunitario aviar.

R3 - Obtención y selección de hasta 6 piensos a escala piloto y cálculo de las cantidades necesarias de cada ingrediente para mantener la efectividad del ingrediente tras los tratamientos necesarios para su adición a los piensos.

Se estipuló que la mejor solución era asegurar la misma concentración de los nutrientes del pienso en todos los lotes e incorporando en las fórmulas los nuevos ingredientes a testar de la siguiente forma: 

- LOTE 1 → 1% DIATOMEA

- LOTE 2 → 0,2% HONGOS + 0,8% DIATOMEA

- LOTE 3 → 0,8% ALGAS + 0,2% DIATOMEA

- LOTE 4 → 0,2% HONGOS + 0,8% ALGAS

Se determinó que todos los piensos se fabricaran con las mismas materias primas por si la valoración de las mismas tras los análisis vía NIR no se ajustaba 100% a la realidad. Se decidió que era preferible evaluar una fórmula para la misma etapa productiva (pienso de arranque) e introducir como variante la presencia o no de coccidiostato en el corrector vitamínico-mineral que, evaluar la fórmula para la otra etapa productiva (pienso de terminación).

En total se formularon y fabricaron 8 tipos de pienso que se identificaron de la siguiente manera:

- T-1: Pienso Control con Corrector Valencia

- T-2: Pienso Control con corrector Valencia + Hongos

- T-3: Pienso Control con corrector Valencia + Algas

- T-4: Pienso Control con corrector Valencia + Hongos + Algas

- T-5: Pienso Control con Corrector Tudela Salino

- T-6: Pienso Control con corrector Tudela + Hongos

- T-7 Pienso Control con corrector Tudela + Algas

- T-8 Pienso Control con corrector Tudela + Hongos + Algas

R2 - Selección de los ingredientes/combinaciones a incorporar en el pienso con mayor capacidad antimicrobiana, inmunomoduladora y/o antiinflamatoria.

Se ha realizado evaluación in vitro de la capacidad antimicrobiana a 3 patógenos aviares y de la capacidad inmunomoduladora y antiinflamatoria de ingredientes de interés para seleccionar los ingredientes con mayor efecto biológico. 

Concretamente, se ha realizado la evaluación de capacidad antimicrobiana de los ingredientes a base de hongos mediante 3 metodologías: método ecométrico, método de turbidez y método de turbidez tras una extracción en metanol de los ingredientes, no siendo posible encontrar efectos antimicrobianos frente a la microbiota diana en las condiciones ensayadas. También se ha realizado la evaluación de los ingredientes mostrando un potencial efecto beneficioso, tanto un efecto inmunoestimulante como antiinflamatorio, permitiendo la selección de las muestras para las próximas actividades (muestra 1 de hongos y muestra Cv (Chlorella vulgari)s de microalgas).

Por haber mostrado un efecto positivo en ambos contextos moleculares o fenotipos de los  macrófagos, se seleccionó la muestra Cv (Chlorella vulgaris) como muestra de alga para incorporar a los  piensos y con la que se testaron las distintas combinaciones a lo largo de todas las actividades del proyecto.

R1 - Selección y fabricación de los ingredientes a base de hongos y microalgas que van a participar en el proyecto de innovación. 

En primer lugar, a partir de los diferentes estudios consultados, se concluye que, los hongos y algunas de sus moléculas pueden jugar un importante papel en la producción avícola: (1) polisacáridos presentes en los hongos pueden actuar como inmunomoduladores y agentes con actividad antibacteriana, antiviral y antiparasitaria; (2) compuestos fenólicos aislados en los hongos pueden actuar como antioxidantes; (3) algunas especies de hongos pueden ser utilizadas en la dieta del pollo de engorde como promotores del crecimiento y como alternativa natural a los antibióticos; (4) algunos hongos pueden mejorar la producción y la calidad de los huevos; (5) algunos hongos pueden utilizarse como una alternativa segura y eficaz para inducir la muda, mejorar la inmunidad, reducir el crecimiento de Salmonella y otros enteropatógenos y retornar a la producción de huevos. Sin embargo, se necesitan estudios adicionales para investigar los efectos de los hongos en la mejora del rendimiento productivo de los pollos y estudiar los mecanismos de acción por los cuales los hongos actúan sobre la microbiota intestinal y la respuesta inmune de las aves.

Tras el análisis bibliográfico, se dió paso al procesado industrial piloto delas muestras de las especies de hongos seleccionadas por su elevado interés científico: Ganoderma lucidum, Lentinula edodes, Agaricus bisporus, Coriolus versicolor, Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris, Pleurotus ostreatus, Grifola frondosa, Polyporus umbellatus, Hericium erinaceus, Pleurotus eryngii y Agaricus blazei.